999精品亚洲国产欧美-免费av在线观看亚洲-亚洲欧美日韩另类丝袜一区-乱码精品一区二区三区

NRK-52E 大鼠腎細(xì)胞詳解

起源與背景

細(xì)胞特性

1. 形態(tài)與生長特征
   • 形態(tài)學(xué)：貼壁生長時(shí)呈鵝卵石樣或多邊形單層排列，細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富且透光性好，細(xì)胞核大而圓，位于細(xì)胞中央（顯微鏡下可見典型的上皮細(xì)胞鋪路石樣結(jié)構(gòu)，圖 1）。
   • 生長動(dòng)力學(xué)：
     • 倍增時(shí)間約24-36 小時(shí)，傳代周期 3-4 天，建議使用20 代以內(nèi)細(xì)胞以維持穩(wěn)定表型。
     • 密度達(dá) 80%-90% 時(shí)需傳代，過度匯合可能導(dǎo)致細(xì)胞接觸抑制，甚至出現(xiàn)去分化現(xiàn)象（如極性丟失、間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)增加）。
2. 表型與功能標(biāo)志物
   • 上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記：
     • 高表達(dá)細(xì)胞角蛋白 18（CK18）、E - 鈣粘蛋白（E-Cadherin）、緊密連接蛋白（ZO-1、Occludin），免疫熒光染色可見細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)呈陽性（圖 2）。
     • 功能性蛋白：鈉 - 葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 2（SGLT2）、Na?/K?-ATP 酶（位于基底膜，維持離子梯度）、水通道蛋白 1（AQP1，參與水分重吸收）。
   • 病理應(yīng)激響應(yīng)：
     • 高糖誘導(dǎo)損傷：25 mM 葡萄糖處理可激活 PKC 通路，導(dǎo)致活性氧（ROS）生成增加、TGF-β1 分泌升高，進(jìn)而誘導(dǎo)上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），表現(xiàn)為 α-SMA（間質(zhì)標(biāo)志物）表達(dá)上調(diào)、E-Cadherin 表達(dá)下降。
     • 順鉑毒性模型：通過順鉑（10-20 μM）處理可模擬 AKI，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（Annexin V/PI 雙染陽性率升高）和炎癥因子（如 IL-6、MCP-1）釋放。
3. 體外功能驗(yàn)證模型
   • 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能：利用 Transwell 小室檢測(cè)跨膜電阻（TER）（正常 TER 值約 500-800 Ω?cm2）和熒光標(biāo)記物（如 FITC - 葡聚糖）的通透性，評(píng)估緊密連接完整性。
   • 細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成：在 TGF-β1（5 ng/mL）刺激下，可顯著增加 **Ⅰ 型膠原、纖連蛋白（FN）** 的 mRNA 和蛋白表達(dá)，模擬腎小管間質(zhì)纖維化過程。

培養(yǎng)與保存條件

1. 基礎(chǔ)培養(yǎng)方案
   • 培養(yǎng)基：經(jīng)典配方為 DMEM/F12（1:1 混合）+10% 胎牛血清（FBS）+1% 雙抗（青霉素 / 鏈霉素），部分實(shí)驗(yàn)為增強(qiáng)上皮特性可添加胰島素 - 轉(zhuǎn)鐵蛋白 - 硒（ITS）復(fù)合物（1×）。
   • 培養(yǎng)環(huán)境：37℃、5% CO?恒溫培養(yǎng)箱，濕度≥95%，pH 7.2-7.4。
   • 傳代操作：
     • 消化：0.25% 胰酶 - EDTA 室溫消化 30 秒 - 1 分鐘，鏡下觀察細(xì)胞變圓、間隙增大時(shí)終止消化（避免過度消化導(dǎo)致細(xì)胞成團(tuán)或損傷）。
     • 傳代比例：1:2-1:3（按細(xì)胞密度調(diào)整），接種密度建議5×10? cells/cm2。
2. 凍存與復(fù)蘇要點(diǎn)
   • 凍存液：90% FBS + 10% DMSO（或使用商業(yè)化細(xì)胞凍存液），細(xì)胞密度調(diào)整為1×10?-3×10? cells/mL，程序降溫（-80℃過夜后轉(zhuǎn)液氮）。
   • 復(fù)蘇技巧：37℃水浴快速解凍（≤1 分鐘），離心（800 rpm×5 分鐘）去除凍存液后，接種于含 15% FBS 的培養(yǎng)基中，24 小時(shí)內(nèi)更換培養(yǎng)液以清除死細(xì)胞。

應(yīng)用領(lǐng)域與典型研究

1. 糖尿病腎?。―N）機(jī)制研究
   • 高糖 / AGEs 模型：通過高葡萄糖（25 mM）或 AGE-BSA（100 μg/mL）處理細(xì)胞，研究mTOR 通路激活對(duì) ECM 沉積的影響，或篩選 PPAR-γ 激動(dòng)劑（如羅格列酮）對(duì) EMT 的抑制作用。
   • 氧化應(yīng)激與炎癥：檢測(cè)高糖條件下 NADPH 氧化酶（NOX4）表達(dá)及 NLRP3 炎癥小體激活，探討 Sirtuin 家族蛋白（如 SIRT1）的腎保護(hù)機(jī)制。
2. 急性腎損傷（AKI）與藥物毒性評(píng)估
   • 順鉑 / 慶大霉素毒性模型：通過劑量梯度實(shí)驗(yàn)（順鉑 5-20 μM）建立 AKI 細(xì)胞模型，檢測(cè)腎損傷分子 - 1（KIM-1）、NGAL的分泌水平，或驗(yàn)證抗氧化劑（如 N - 乙酰半胱氨酸）的保護(hù)效應(yīng)。
   • 新型藥物腎毒性篩選：利用 CCK-8 法、LDH 釋放實(shí)驗(yàn)評(píng)估候選藥物對(duì) NRK-52E 細(xì)胞的存活率影響，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析凋亡（Annexin V）和壞死（PI）比例。
3. 腎小管上皮細(xì)胞生物學(xué)研究
   • EMT 與纖維化機(jī)制：TGF-β1 誘導(dǎo) EMT 模型中，研究 miRNA-21/PTEN 通路對(duì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控，或探索間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì) EMT 的逆轉(zhuǎn)作用。
   • 細(xì)胞極性與轉(zhuǎn)運(yùn)功能：通過 RNA 干擾敲低 ZO-1，觀察緊密連接破壞后溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)異常，或研究 Wnt/β-catenin 通路對(duì)上皮極性的維持作用。
4. 腎臟修復(fù)與再生研究
   • 生長因子促進(jìn)修復(fù)：探討肝細(xì)胞生長因子（HGF）或表皮生長因子（EGF）對(duì)劃痕**實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用，或驗(yàn)證低氧預(yù)處理（1% O?）對(duì)細(xì)胞抗損傷能力的增強(qiáng)效應(yīng)。
   • 表觀遺傳調(diào)控：研究組蛋白去乙?；福℉DAC6）抑制劑對(duì) NRK-52E 細(xì)胞線粒體功能的保護(hù)作用，或分析長鏈非編碼 RNA（如 lncRNA MALAT1）在 AKI 中的表達(dá)變化及機(jī)制。

局限性與注意事項(xiàng)

1. 模型局限性
   • 永生化帶來的功能偏差：與原代近端小管細(xì)胞相比，NRK-52E 細(xì)胞的刷狀緣酶（如堿性磷酸酶、γ- 谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶）活性較低，部分藥物代謝酶（如 CYP450）表達(dá)缺失，復(fù)雜代謝研究需結(jié)合原代細(xì)胞或肝 - 腎共培養(yǎng)模型。
   • 株系特異性：不同實(shí)驗(yàn)室保存的 NRK-52E 細(xì)胞可能存在微小遺傳差異，建議通過短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）鑒定確認(rèn)細(xì)胞身份，避免交叉污染（如與成纖維細(xì)胞株混淆）。
2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)
   • 血清饑餓處理：在刺激實(shí)驗(yàn)（如細(xì)胞因子、藥物處理）前，建議用無血清培養(yǎng)基饑餓 12-24 小時(shí)，以排除血清中生長因子的干擾（如 EGF 可能激活 MAPK 通路）。
   • 多重模型驗(yàn)證：關(guān)鍵機(jī)制研究需結(jié)合體內(nèi)模型（如大鼠順鉑腎損傷模型）或類器官模型（如腎小管類器官），以彌補(bǔ)體外模型與真實(shí)病理環(huán)境的差異。
3. 質(zhì)量控制
   • 污染檢測(cè)：定期通過支原體檢測(cè)試劑盒（如 qPCR 法）排除污染，避免真菌、細(xì)菌或交叉污染導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠。
   • 表型穩(wěn)定性：傳代超過 20 代后，部分細(xì)胞可能出現(xiàn) EMT 樣表型（如 α-SMA 基礎(chǔ)表達(dá)升高），建議凍存低代次細(xì)胞（≤10 代）并定期復(fù)蘇使用。

總結(jié)